Potansiyel Alerjen Metiyonin Sentazın Fisyon Mayasında Rekombinant Olarak Üretimi

Abstract

Amaç: Alerjik duyarlılığa ve alerjik hastalık bulgularının ortaya çıkmasına neden olan en önemli aeroalerjenlerden biri polenlerdir. Polenlerin alerjenik özellikleri, kimyasal bileşenleri ve atmosferdeki yoğunlukları, iklime, coğrafi lokasyona ve çevresel koşullara göre değişir. Bu etkenler polen alerjisinin tanı ve tedavisini olumsuz etkilemektedir. Günümüzde tanı ve tedavideki etkinliği artırmak için rekombinant alerjenler üretilmektedir. Bu çalışmada yerel Morus alba L. (ak dut) poleninden izole edilen potansiyel alerjen metiyonin sentazın ökaryotik bir model organizma olan fisyon mayasında (Schizosaccharomyces pombe) rekombinant olarak üretimi amaçlanmıştır. Yöntem: M. alba polenlerinden total RNA izolasyonu yapıldıktan sonra cDNA kütüphanesi oluşturulmuştur. Bu cDNA kütüphanesinden polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılan metiyonin sentaz geninin (metE) doğrulaması nükleotit dizilemesi ile belirlenmiştir. Doğrulama sonrasında metE’nin mekik tipi bir vektör olan pSLF1073 ile ligasyonu yapıldıktan sonra S. pombe’ye transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Transformant kolonilerden protein izolasyonu gerçekleştirildikten sonra rekombinant protein, SDS-PAGE’yi takiben Coomasssie boyama ve Western blot yöntemleri kullanılarak saptanmıştır. Bulgular: M. alba polenlerinden oluşturulan cDNA kütüphanesinden, PZR yöntemi ile metE geni çoğaltılmış ve dizisi belirlenmiştir. Rekombinant plazmid aktarılmış transformant S.pombe hücrelerinden izole edilen proteinlerin Coomassie boyaması sonucunda 85 kDa’luk bir bant sadece transformant hücrelerde gözlenmiş, konakta yer almadığı belirlenmiştir. Aynı bulgular 6x His etiketli antikor kullanılarak yapılan Western blot işlemi ile de elde edilmiştir. Sonuç: Sonuç olarak, M. alba metE geni ilk kez bu çalışma kapsamında S.pombe’ye klonlanmıştır ve rekombinant alerjen üretiminde S. pombe’nin de etkin bir şekilde kullanılabileceği ortaya konulmuştur. Eldeki verilerden ve kazanılmış deneyimlerden yola çıkarak ileride gerçekleştirilecek tanı kiti ve aşı üretimi çalışmaları hastaların tedavi şansını artıracak, %100 ithal farmasötiklere dayalı alerji tanı ve tedavi maliyetlerini ve dışa bağımlılığı düşürecektir.